Bio-sep  LH-20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Bio-sep  LH-20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
    Bio-sep  LH-20洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇-水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。正相系统以氯仿-甲醇最为常见，先用50％氯仿-甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
    如果样品极性大，请选用反相溶剂洗脱（甲醇-水），样品用最少体积的甲醇-水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要过滤！如果堵住了 Bio-sep  LH-20，就得将Sephadex LH20的柱头部分弃去，很可惜）。如果样品极性小，就选用正相溶剂洗脱（氯仿-甲醇），样品用最少体积的氯仿-甲醇溶解，过滤后，湿法上样。